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如何使用離心機(jī)分離真核生物細(xì)胞器

時間:2017年08月10日 信息來源:湘智離心機(jī) 字體: 打印此頁

將動植物組織制成勻漿,在適當(dāng)?shù)膽腋〗橘|(zhì)中用差速離心法可以分離細(xì)胞線粒體。在一定的離心場中(選用離心機(jī)的一定轉(zhuǎn)速),球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時間,組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其他內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間,就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部,從而分批收集。細(xì)胞器沉降先后順序是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。

懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液,它較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相,在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性;pH7.2的條件下;亞細(xì)胞組分不容易重新聚集成團(tuán),有利于分離。整個操作過程樣品要保持在0℃~4℃,避免酶失活。

細(xì)胞器標(biāo)記酶的測定是評價細(xì)胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù),如線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶,該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色,而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。

詹納斯綠B是一種活體染料,能對動、植物的細(xì)胞或組織在活體狀態(tài)下進(jìn)行無毒害的染色。由于染料(堿性染料)的膠粒表面帶有陽離子,酸性染料的膠粒表面帶陰離子,而被染部分本身具有陰離子或陽離子,這樣,它們彼此之間發(fā)生吸引作用,染料就被堆集下來。染色法可以顯示出活細(xì)胞內(nèi)的某種天然結(jié)構(gòu)存在的真實性,而不影響細(xì)胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以至引起細(xì)胞的死亡。

差速離心:使用湘智高速冷凍離心機(jī), 0.34 mol/L蔗糖溶液4.5mL放入離心管,然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝勻漿覆蓋于上層。用冷凍控溫的高速離心按下圖順序進(jìn)行差速離心。

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------ 責(zé)任編輯:許海龍

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