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IEF分離蛋白質(zhì)方法

時(shí)間:2015年12月22日 信息來(lái)源:湘智離心機(jī) 字體: 打印此頁(yè)

實(shí)驗(yàn)試劑

樣品提取液(8M尿素、2%非離子型去污劑NP-40、2%Ampholin,pH3.5-10、2%DTT)

膠母液 (30%的29/1的Acr/Bis),兩性電解質(zhì)

陽(yáng)極緩沖液 1M磷酸

陰極緩沖液 1M氫氧化鈉

固定液(10%的三氯乙酸、1%的磺基水楊酸)

染色液(35%乙醇、10%冰醋酸、0.15%考馬氏亮藍(lán)R250)

脫色液(35%乙醇、10%冰醋酸)

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

高壓電泳儀、IEF槽、離心機(jī)

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣品提取

   1) 1ml原核表達(dá)細(xì)胞液離心取沉淀

   2) 沉淀用100ulIEF樣品緩沖液裂解,離心取上清

2. 制膠

   1) 安裝超薄膠裝置

   2) 依次加入下述試劑

            膠母液             2ml

            尿素               8M    /脫氣

            NP-40            0.2ml

            兩性電解質(zhì)         2ml

            10%過(guò)硫酸胺       50ul

            TEMED             5ul

   3) 倒膠

3. 電泳

   1) 預(yù)電泳膠凝固后,拆卸制膠裝置,將膠連同支持膜一起置于水平電泳槽上(要求,電泳槽面板上首先被液體石蠟浸潤(rùn),在凝膠支持膜與電泳槽面板間無(wú)氣泡)。

   2) 將分別被陰陽(yáng)極緩沖液浸潤(rùn)的電極條置于膠面上將與陰陽(yáng)電極接觸的部位,蓋上電泳槽罩子,連通電源,200V預(yù)電泳10min。

   3) 電泳,將薄棉紙剪成小塊,輕輕置于預(yù)備點(diǎn)樣的膠面上,取10-15ul樣品液,點(diǎn)于薄棉紙上,蓋上罩子,連通電源進(jìn)行電泳

   4) 電泳參數(shù)

    200V 30min,400V 30min,800V4hr

4. 染色

   1) 固定,將電泳完的膠連同支持膜放置于固定液中,10min.

   2) 顯色,50℃下,將膠與支持膜放置于染色液中,顯色,直至條帶出現(xiàn)。



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